Ao oferecer uma análise mais sensível e seletiva, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) é a base da pesquisa farmacêutica moderna. Em análises farmacêuticas, acurácia e consistência dos resultados é essencial para manutenção da qualidade do produto e conforme a instrumentação se torna mais sensível, cada material usado na análise necessita ser usado garantindo os melhores resultados possíveis. Seja ele o solvente, a coluna do HPLC ou o gás fornecido ou detector seletivo de massas (MSD), cada componente da análise pode potencialmente impactar na qualidade dos resultados, por meio de efeitos de matriz e supressão de íons. (1)
O efeito de matriz pode ser definido como o efeito combinado de todos os componentes em uma amostra além do analito de interesse (2). Dependendo do método de preparação de amostra e da origem da mesma, a matriz de fundo terá um impacto maior ou menor na habilidade do analista detectar, confiável e repetidamente, os compostos de interesse (3). A supressão de íons é uma forma de efeito de matriz, no qual a origem nem sempre é fácil de determinar. Embora os mecanismos de supressão não são sempre claros, impurezas no gás fornecido ao equipamento é um efeito que pode causar redução na relação sinal-ruído (S/N), o que pode fazer com que o sistema não forneça resultados com repetibilidade ou até não passe nos testes iniciais para checar a performance do sistema. Uma comparação da reposta de monitoramento de reações múltiplas (MRM) a um composto padrão comumente usado, como a reserpina, gerará dados de S/N que mostram se a sensibilidade do sistema está dentro da especificação esperada.
Comparando o sinal do analito na matriz com o padrão em solvente puro, é possível observar se existem interferências que causam supressão de íons. Novamente, isso poderá evidenciar que o efeito está ocorrendo, mas não necessariamente permitirá o analista a localizar a origem da impureza que está afetando o desempenho.
O gerador de nitrogênio Genius XE 35
Em muitos cenários, os instrumentos de fornecimento de gás podem ser a fonte de interferências e sinais de fundo. Laboratórios farmacêuticos tendem a usar nitrogênio abastecido por múltiplos cilindros, dewar de nitrogênio líquido ou por um gerador. Os geradores e nitrogênio, como o Genius XE da Peak, removem muitos dos problemas do suprimento de nitrogênio à granel, incluindo pedidos frequentes e gerenciamento do estoque e das entregas. Com um gerador, os laboratórios também não precisam se preocupar com interrupções no fornecimento e podem evitar o risco de ficar sem gás de uma hora para outra, bem como a inconveniência adicional de trocar cilindros ou tanques quando eles acabam. Além disso, com um gerador, os laboratórios podem remover a imprevisibilidade dos preços do gás que podem flutuar rapidamente, reduzir as preocupações com saúde e segurança para os trabalhadores de laboratório que precisam mover cilindros pesados pelo laboratório, sem mencionar o perigo de ter grandes quantidades de nitrogênio líquido no laboratório, que tem o potencial de alterar rapidamente a composição atmosférica do laboratório, representando um risco para o pessoal do laboratório caso a ventilação seja inadequada ou falhe (4).
Os geradores Genius XE foram desenvolvidos para oferecer pureza líder de mercado de nitrogênio grau LC-MS para garantir que os laboratórios possam se concentrar em suas análises, com a segurança de que a pureza do gás fornecido pelo gerador de gás fornecerá os melhores resultados possíveis.
Os geradores Genius XE usam uma membrana para purificar o gás do ar comprimido. A purificação de membrana usa um feixe de polímero de fibra oca que separa o oxigênio do ar comprimido de entrada, permitindo que moléculas menores de oxigênio passem pelas paredes laterais das fibras, enquanto moléculas maiores de nitrogênio são retidas dentro do feixe de membrana e coletadas em um tanque receptor. Este método de purificação de nitrogênio pode produzir nitrogênio de alta pureza em até 99,5% nas taxas de fluxo necessárias para aplicações de LC-MS (normalmente 15-70LPM, dependendo do instrumento).
O que são NMHCs e por que são potencialmente um problema?
Como o processo de purificação de N2 depende do uso de ar ambiente, que é comprimido pelos compressores livres de óleo internos no gerador, quaisquer impurezas ambientais são um risco para a pureza geral do gás, uma vez que a purificação por membrana pode não purgar impurezas junto com o oxigênio em função de seu tamanho molecular. Portanto, em alguns ambientes de laboratório, ou sem filtração adequada, compostos adicionais que estão presentes no ar podem ser passados para o espectrômetro de massas, o que pode afetar a sensibilidade e impactar os intervalos de manutenção.
Vários hidrocarbonetos de cadeia pequena, incluindo etano, propano, butano e pentano, conhecidos como hidrocarbonetos não metano (NMHC), são encontrados na atmosfera em uma faixa de concentrações de partes por bilhão (ppb) a partes por milhão (ppm), dependendo da época do ano e da geografia (5). Os NMHCs são conhecidos por desempenhar um papel importante na química atmosférica e podem representar um problema para pesquisadores em laboratórios, uma vez que podem causar interferência nos resultados analíticos, dependendo da natureza da análise.
Desenvolvendo uma solução inovadora
Reconhecendo os desafios dos ambientes de laboratório e a necessidade de reduzir o potencial de impacto da qualidade do gás nos resultados, a nova tecnologia de remoção de hidrocarbonetos proprietária foi projetada para o Genius XE para fornecer aos laboratórios maior proteção contra possível contaminação ambiental. Alguns laboratórios usam armadilhas nas linhas de gás para reduzir o efeito do NMHC na análise, mas a maioria das opções no mercado tem uma capacidade muito baixa e não oferece uma solução de longo prazo para os desafios dos ambientes de laboratório, resultando em trocas frequentes de filtros e um aumento no custo de operação.
A filtração resultante foi desenvolvida para garantir uma pureza de nitrogênio mais alta do que seria possível eliminando NMHC do ar ambiente. Testes no Laboratório de Física Nacional no Reino Unido mostraram que o Genius XE pode reduzir os níveis de NMHC para níveis de < 1 ppm. O estágio avançado de filtração NMHC introduzido no Genius XE oferece maior confiança em seus resultados, especialmente ao executar análises de maior sensibilidade ou onde a presença de NMHCs excessivos pode interferir com os analitos alvo.
Metódos
A Peak Scientific executou uma comparação entre o Genius XE e um gerador sem tecnologia específica de remoção de hidrocarbonetos para comparar o desempenho do gerador ao verificar a relação S/N durante a verificação de um espectrômetro de massa 6495 Triple Quad da Agilent em um ambiente de laboratório desafiador.
Cinco replicatas foram conduzidas usando cada um dos dois padrões: cloranfenicol e reserpina. O espectrômetro foi operado em modo positivo para testar o S/N da reserpina e em modo negativo para cloranfenicol.
Resultados
Os resultados mostraram uma grande diferença no desempenho dos dois geradores ao operar no modo de íons positivos. A relação S/N do pico de cloranfenicol com o LC-MS em execução no modo de íons negativos mostra que, sem a tecnologia de remoção de HC, uma diminuição dramática em S/N pode ser observada em alguns ambientes de laboratório. Uma média de cinco injeções mostrou que sem a remoção de hidrocarbonetos, o S/N era de cerca de 2.200:1 em comparação com 93.000:1 com a remoção de hidrocarbonetos no local.
Ao executar um padrão de reserpina no modo de íon positivo, novamente uma grande diferença na S/N foi observada, com a tecnologia de remoção de hidrocarbonetos do Genius XE dando uma relação S/N média de 113.431: 1 para cinco injeções de reserpina, em comparação com 36.526: 1 para amostras executadas usando um gerador sem remoção de hidrocarbonetos.
| Standard tested | Chloramphenicol (-ve mode) | Reserpine (+ve mode) | ||
|---|---|---|---|---|
|
|
|
|
|
|
|
Replicate 1 S/N |
2178 |
99927 |
49139 |
118262 |
|
Replicate 2 S/N |
2039 |
76943 |
26706 |
134984 |
|
Replicate 3 S/N |
1532 |
126961 |
25523 |
115225 |
|
Replicate 4 S/N |
2566 |
80180 |
37926 |
110140 |
|
Replicate 5 S/N |
2578 |
83001 |
43334 |
88546 |
|
Average S/N |
2179 |
93402 |
36526 |
11343 |
Discussão
Embora a infraestrutura e os processos do laboratório estejam constantemente melhorando, o efeito do ambiente e as mudanças nas impurezas transportadas pelo ar ainda estão além do controle de muitos sistemas de ar-condicionado de laboratório. Flutuações sazonais que resultam em mudanças de temperatura e precipitação podem alterar os níveis de poluentes transportados pelo ar (6), particularmente em grandes cidades (5), o que pode impactar na qualidade do ar do laboratório sem que nenhuma mudança perceptível seja necessariamente notada pela equipe. Os geradores de gás são um dos vários componentes que interagem direta ou indiretamente com a amostra ou o detector por meio dos processos envolvidos na preparação e análise da amostra e podem afetar os resultados. Outros componentes que foram identificados como potencialmente introdutores de efeitos de matriz nas amostras incluem solventes, que sempre devem ser selecionados cuidadosamente para evitar interação com as condições de ionização e tubos usados para fornecer gás ao espectrômetro de massa. Se um tubo de plástico de baixa qualidade for usado, que libere grandes quantidades de plastificantes, isso pode causar efeitos de matriz, em termos de mascaramento de analitos alvo e pode afetar diretamente o desempenho do instrumento como consequência da liberação de gases voláteis que causam supressão de íons. Se forem usados tubos de metal, tubos de aço inoxidável ou cobre para laboratório devem ser usados, evitando-se resinas epóxi para selar as juntas.
O reconhecimento da importância de cada etapa do processo na obtenção dos melhores resultados significa que, à medida que os instrumentos analíticos melhoram, é necessário que todos os produtos periféricos, incluindo os geradores de gás, se mantenham atualizados. Este tem sido um motivador para o desenvolvimento de novos produtos da Peak e introdução de novas tecnologias no Genius XE. Os resultados desta análise mostram a importância da tecnologia de remoção de hidrocarbonetos empregada nos geradores de nitrogênio Genius XE para a redução da supressão de íons e demonstra como o desempenho do LC-MS pode ser aprimorado usando este gerador de nitrogênio de última geração.
Referências
- Silvestro, L., Tarcomnicu, & Savu, S. (2013) Matrix effects in mass spectrometry combined with separation methods - comparison HPLC, GC and discussion on methods to control these effects. lntech Ltd.
- IUPAC Gold Book: Matrix Effect
- Kim, H-J. & Kang, J- S. (2016) Matrix effects: hurdle for development and validation of bioanalytical LC-MS methods in biological samples. Biodesign 4(2), 46-48
- Eiga - Hazards of oxygen-deficient atmospheres
- Radaideh, J. (2017) Effect of meteorological variables on air pollutants in arid climates. Journal of Environmental & Analytical Toxicology 7:4 DOI:10.4172/2161-0525.1000478
- Eiga - Hazards of oxygen-deficient atmospheres